本发明属于过山蕨总黄酮应用技术领域,具体涉及过山蕨总黄酮作为赖氨酸氧化酶抑制剂,在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用,如预防化学致癌(如肺癌、乳腺癌和紫外线引起的皮肤癌等),阻止肿瘤细胞生长和转移,增强肿瘤化疗效果等。
1.过山蕨总黄酮作为赖氨酸氧化酶抑制剂,在制备抗皮肤癌药物方面的应用。技术领域
本发明属于过山蕨总黄酮应用技术领域,具体涉及过山蕨总黄酮作为赖氨酸氧化酶抑制剂,在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用,如预防化学致癌(如肺癌、乳腺癌和紫外线引起的皮肤癌等),阻止肿瘤细胞生长和转移,增强肿瘤化疗效果等。
背景技术
肿瘤是一种严重危害人体健康的重大疾病,虽然传统的治疗方法如手术、化疗和放疗对早期肿瘤控制有了很大提高,但由于肿瘤早期症状的隐蔽性,多数恶性肿瘤一发现即处于中晚期,加上目前肿瘤发生的病因不完全清楚,进一步探索肿瘤发生的原因和发现新的治疗药物仍是肿瘤研究的重要任务。低氧是实体肿瘤的一个典型特征,利用这个现象创造的2-(¹⁸F)-D-脱氧葡萄糖-正电子发射断层扫描技术(FDG-PET)已广泛用于肿瘤影像学诊断,其在鉴别肿块良、恶性及评价其恶性程度、判断淋巴结转移及远处转移、辅助临床分期和评估治疗疗效及预后等方面均发挥着重大作用。低氧微环境有利于肿瘤细胞抵抗凋亡和基因异质性,对肿瘤的发生、发展和转移均有促进作用,也降低肿瘤细胞对放化疗的敏感性,是制约肿瘤患者治疗效果的主要障碍之一,靶向低氧微环境已经成为发展肿瘤治疗新方法的重要措施。赖氨酸氧化酶是一种以铜离子为辅酶、催化细胞外环境中胶原和弹性蛋白共价交联的氨基氧化酶,决定着细胞外基质和结缔组织的机械性能,也是肿瘤低氧微环境主要的调控因子-低氧诱导因子的执行者,在多种肿瘤中都有明显上调,对肿瘤发展和转移有促进作用,是目前肿瘤治疗潜在的重要靶点之一。过山蕨,xa0又名马蹬草、还阳草、过桥草,xa0为铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorusxa0sibiricusxa0Rupr.)xa0的地上全草,主产于东北、华北、西北、内蒙古等地,历代本草未见有关其药用记载,民间用于治疗外伤出血、子宫出血、血栓闭塞性脉管炎、神经性皮炎、脑栓塞引起的偏瘫以及糖尿病并发症等。现代药理研究表明过山蕨水醇提取液对兔耳血管、蟾蜍后肢血管以及家兔肢体后肢血管有扩张作用,xa0其有效部位为黄酮和有机酸。本申请首次发现过山蕨总黄酮是一个赖氨酸氧化酶抑制剂,具有很好的预防和治疗肿瘤作用,进而对其在肿瘤中潜在的临床应用进行了深入的研究。
发明内容
本发明目的在于提供过山蕨总黄酮作为赖氨酸氧化酶抑制剂,在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:过山蕨总黄酮作为赖氨酸氧化酶抑制剂,在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用进一步的,过山蕨总黄酮在制备抗癌药物方面的应用,尤其是过山蕨总黄酮在制备抗皮肤癌、肺癌和乳腺癌药物方面的应用。过山蕨总黄酮作为一个赖氨酸氧化酶抑制剂,可以在肿瘤预防和治疗方面有广泛作用,包括肿瘤预防、治疗、辅助化疗及术后应用。其动物有效剂量范围为口服10-1000mg/kg体重/日、注射5-500mgxa0/xa0kg体重/日,优选剂量为口服50-500mgxa0/kg体重/日、注射20-200mgxa0/kg体重/日。推算的人用有效剂量范围为口服80-8000mgxa0/日、注射50-5000mgxa0/日,优选剂量为口服0.5-5g/日、注射0.2-2g/日。所述过山蕨总黄酮可按照本领域常规技术进行提取即可。如,在本发明中,过山蕨总黄酮可按下述方法获取:将洗净、烘干、粉碎过的过山蕨地上全草经石油醚脱脂后,用体积浓度50-60%的乙醇水溶液按液料比25-35∶1于85±5°C提取2次,每次2h,过滤,合并提取液并浓缩至每ml相当于0.1g原药材,分别用95%乙醇(指体积浓度,下同)、70%乙醇各醇沉1次,过滤,滤液再经大孔吸附树脂吸附、60%乙醇洗脱,洗脱液真空干燥后即得。以芦丁为标准经分光光度测定总黄酮含量>90%。本发明经试验发现:过山蕨总黄酮能抑制诱癌组织和肿瘤组织赖氨酸氧化酶,其作为赖氨酸氧化酶抑制剂可用于预防和治疗多种肿瘤,并有化疗增效作用。过山蕨总黄酮对UVB引起的小鼠皮肤癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌均有显著降低发病率作用(见图1、图2);对小鼠lewis肺癌皮下肿瘤及小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤均有明显抑制生长和阻止自发转移及人工被动转移作用(见图3、图4、图5),能抑制诱癌组织和肿瘤组织赖氨酸氧化酶(见图6)。过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被动转移均有显著抑制作用(见图7)。过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤均有增效作用(见图8、图9)、可以阻止小鼠4T1乳腺癌术后复发(见图10、图11)。综合上述试验结果,本发明内容可概括以下几个方面:1过山蕨总黄酮对诱癌组织和瘤组织赖氨酸氧化酶有抑制作用,是一个较好的赖氨酸氧化酶抑制剂。2过山蕨总黄酮对UVB引起的小鼠皮肤癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌均有抑制作用,可以预防肿瘤发生。3过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌皮下肿瘤及小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤生长和2种肿瘤自发肺转移均有阻止作用,可以抑制肿瘤生长和自发转移。4过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被动转移也有抑制作用,可以阻止肿瘤被动转移。5过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤均有协同生长抑制作用,可以提高肿瘤化疗效果。6过山蕨总黄酮对小鼠4T1乳腺癌术后复发有阻止作用,可以预防肿瘤术后复发。
附图说明
图1代表过山蕨总黄酮对UVB引起的小鼠皮肤癌、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤癌及乌拉坦引起的小鼠肺癌发病率的影响;xa0图2代表过山蕨总黄酮对UVB引起的小鼠皮肤肿瘤数、二甲基苯蒽/巴豆油引起的小鼠皮肤肿瘤数及乌拉坦引起的小鼠肺癌结节数的影响(n=20);注:与模型组比较xa0¹P<0.05,^xa02P<0.01;图3代表过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图4代表过山蕨总黄酮对小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤生长的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图5代表过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌皮下肿瘤及小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤大小及肺转移的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图6代表过山蕨总黄酮对诱癌组织和肿瘤组织赖氨酸氧化酶的影响(n=3);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图7代表过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌和小鼠4T1乳腺癌人工被动转移的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图8代表过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图9代表过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷腺癌、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤大小及肺转移的影响(n=10);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图10代表过山蕨总黄酮对小鼠4T1乳腺癌术后复发的影响(n=20);注:与模型组比较xa0²P<0.01;图11代表过山蕨总黄酮对小鼠4T1乳腺癌术后小鼠存活的影响。
具体实施方式
本发明对过山蕨总黄酮作为一个赖氨酸氧化酶抑制剂及其在肿瘤中的应用进行了试验,过山蕨总黄酮口服、注射均有效,下面各试验以过山蕨总黄酮口服为例。试验中用到的过山蕨总黄酮按下述方法获取:将洗净、烘干、粉碎过的过山蕨地上全草经石油醚脱脂后,用体积浓度55%的乙醇水溶液按液料比30∶1于85°C提取2次,每次2h,过滤,合并提取液并浓缩至每ml相当于0.1g原药材,分别经95%乙醇(添加量以乙醇浓度占溶液体积总量的80%为宜)、70%乙醇(添加量以乙醇浓度占溶液体积总量的50%为宜)各醇沉1次,过滤,滤液再经大孔吸附树脂吸附、60%乙醇洗脱,洗脱液真空干燥后即得黄色的粉状固体过山蕨总黄酮。以芦丁为标准经分光光度测定总黄酮含量>90%。实验1.xa0过山蕨总黄酮对UVB引起小鼠皮肤癌的影响实验方法:将100只昆明小鼠适应性喂养1周后随机分为5组,每组20只,雌雄各半,分别为:正常对照组,模型组,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、xa050mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日)。正常组和模型组饮正常水和食正常饲料。过山蕨总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将过山蕨总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠,从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。除正常对照组小鼠外,将其他实验组小鼠用理发电推除去背部毛发,放入固定鼠背的装置中,用紫外线(UVBxa0275-390nm)xa030xa0mJ/cm²xa0照射小鼠背部剃毛区2次/周,连续44周。第45周计数各组出现皮肤肿瘤的小鼠数和每只小鼠皮肤出现的肿瘤数。颈椎脱臼法处死全部小鼠,切取照射部位冻存于-80°C用于致癌组织赖氨酸氧化酶检测。结果:模型组20只小鼠全部发生皮肤癌,平均每鼠发生皮肤肿瘤的数目为4.8个;过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组20只小鼠发生皮肤癌的小鼠分别为12只、10只、9只,平均每鼠发生皮肤肿瘤的数目分别为3个、2.6个、2.2个(见图1、图2)。实验2.xa0过山蕨总黄酮对二甲基苯蒽/巴豆油引起小鼠皮肤癌的影响实验方法:将100只昆明小鼠适应性喂养1周后随机分为5组,每组20只,雌雄各半,分别为:正常对照组,模型组,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日)xa0。正常组和模型组饮正常水和食正常饲料。过山蕨总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将过山蕨总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠,从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。除正常对照小鼠外,将其他实验组小鼠用理发电推除去背部毛发,于实验第1天背部脱毛区涂二甲基苯蒽丙酮液200μl(150μg),每周1次,共4次;第22天起在相同部位涂0.25%巴豆油丙酮液200μl,每周2次,连续20周。第40周计数各组出现皮肤肿瘤的小鼠数和每只小鼠皮肤出现的肿瘤数。颈椎脱臼法处死全部小鼠,切取诱癌部位冻存于-80°C用于致癌组织赖氨酸氧化酶检测。结果:模型组20只小鼠全部发生皮肤癌,平均每鼠发生皮肤肿瘤的数目为3.5个;过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组20只小鼠发生皮肤癌的小鼠分别为13只、12只、10只,平均每鼠发生皮肤肿瘤的数目分别为1.8个、1.5个、1.1个(见图1、图2)。实验3:过山蕨总黄酮对乌拉坦引起小鼠肺癌的影响实验方法:将100只昆明小鼠适应性喂养1周后随机分为5组,每组20只,雌雄各半,分别为:正常对照组,模型组,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日)xa0。正常组和模型组饮正常水和食正常饲料。过山蕨总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将过山蕨总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠,从实验分组后开始到处死小鼠全程喂饲。除正常对照小鼠外,其他实验组小鼠于实验第1天腹腔注射乌拉坦1000mg/kg,每周1次,共5次。第30周颈椎脱臼法处死全部小鼠,计数各组出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数,并取小鼠肺脏冻存于-80°C用于致癌组织赖氨酸氧化酶检测。结果:模型组20只小鼠全部发生皮肤癌,平均每鼠发生肺肿瘤结节的数目为11.8个;过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组20只小鼠发生皮肤癌的小鼠分别为15只、13只、11只,平均每鼠发生肺肿瘤结节的数目分别为7.5个、6.1个、4.5个(见图1、图2)。实验4:过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌皮下肿瘤、小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤及两种肿瘤自发肺转移的影响实验方法:取对数生长期Lewis肺癌细胞,用生理盐水调细胞数5×10⁵个/ml,以0.2ml/只接种于40只雌性C57BLxa0/6小鼠右前肢腋部皮下;或取对数生长期4T1乳腺癌细胞,用生理盐水调细胞数3×10⁵个/ml,以0.1ml/只接种于40只雌性BALB/c小鼠右侧第2乳头脂肪垫下。将肿瘤接种小鼠随机分为4组,每组10只,分别为:模型组,xa0过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日),另设10只未接种肿瘤的小鼠平行饲养为正常对照组。肿瘤接种后次日,模型组和正常组小鼠灌胃生理盐水10ml/kg,xa0过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组小鼠分别灌胃相应剂量的过山蕨总黄酮水溶液,每日1次,连续4周,肿瘤长出后每周用游标卡尺测量肿瘤直径2次。肿瘤大小按下式计算:xa0肿瘤体积(xa0mm³)xa0=xa0肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/xa02。末次给药后次日颈椎脱臼法处死全部小鼠,剥离接种部位肿瘤,称重,取部分瘤组织冻存于-80°C用于瘤组织赖氨酸氧化酶检测。另剥离小鼠肺脏,检测出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数,评价过山蕨总黄酮对两种肿瘤自发肺转移的影响。结果:模型组小鼠肺癌皮下肿瘤及原位乳腺肿瘤生长较快,并全部出现肺转移。与模型组比较,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组小鼠肺癌皮下肿瘤及原位乳腺肿瘤生长均有不同程度明显减缓,同时可阻止两种肿瘤肺转移(见图3、图4、图5)。实验5:过山蕨总黄酮对诱癌组织及瘤组织赖氨酸氧化酶的影响实验方法:将收集冻存的致癌组织和瘤组织用RIPA强裂解液(50xa0mMTris–HCl,xa0pHxa07.4,xa0150xa0mMxa0NaCl,xa01%TritonX-100,xa01xa0mMxa0EDTA,xa0100xa0mMxa0NaVO3,xa01xa0mMxa0PMSF,xa00.1%xa0SDS,xa01%去氧胆酸钠,另加蛋白酶抑制剂混合物)提取蛋白。上样50μg蛋白,经10%xa0SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上(德国),4°C、5%脱脂奶粉-Tris盐酸缓冲液(TBS)封闭,将兔抗(鼠)赖氨酸氧化酶C末端单克隆抗体(Anti-lysylxa0oxidase,xa01:100,Sigma-Aldrich)或兔抗(鼠)β肌动蛋白单克隆抗体(Anti-β-Actin,xa01:100,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)加入含5%脱脂奶粉的TBS中,室温下与PVDF膜结合孵育1h,再与辣根过氧化物酶偶联的鼠抗IgG(1:200)二抗室温下在含5%脱脂奶粉的TBS中结合孵育30mins。抗原抗体结合物检测用化学发光增强底物试剂盒进行,光带的相对光密度用赖氨酸氧化酶和β肌动蛋白的光密度比值表示。结果:诱癌组织与其相应的正常组织比较,赖氨酸氧化酶的光密度值明显升高,过山蕨总黄酮治疗后诱癌组织赖氨酸氧化酶的光密度值均有不同程度降低,其中过山蕨总黄酮50mg/kg体重/日和100mg/kg体重/日组使诱癌组织赖氨酸氧化酶的光密度值降到相应的正常组织。小鼠lewis肺癌皮下肿瘤及小鼠4T1乳腺癌原位肿瘤经不同剂量过山蕨总黄酮治疗后瘤组织中赖氨酸氧化酶的光密度值比未经过山蕨总黄酮治疗的肿瘤组织显著降低(见图6)。实验6:过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌人工被动肺转移的影响实验方法:取对数生长期Lewis肺癌细胞或4T1乳腺癌细胞,xa0用生理盐水调细胞数1×10⁵xa0个/ml,以0.2ml/只尾静脉注射接种于40只雌性C57BLxa0/6小鼠或BALB/c小鼠。将肿瘤接种小鼠随机分为4组,每组10只,分别为:模型组,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日)。肿瘤接种后次日,模型组和正常组灌胃生理盐水10ml/kg,过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组分别灌胃相应剂量的过山蕨总黄酮水溶液,每日1次,连续4周。末次给药后次日颈椎脱臼法处死全部小鼠,剥离小鼠肺脏,检测出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数,评价过山蕨总黄酮对小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌人工被动肺转移的影响。结果:小鼠lewis肺癌和4T1乳腺癌模型组人工被动肺转移后10只小鼠肺部均出现多处肿瘤转移结节。与模型组比较,过山蕨总黄酮中剂量和高剂量组小鼠发生肺转移的小鼠数和肺转移结节数均有明显减少。过山蕨总黄酮低剂量组小鼠发生肺转移的小鼠数虽无降低,但肺转移结节数也明显减少(见图7)。实验7:过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷酰胺、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响实验方法:取生长良好的lewis肺癌传代实体瘤,用生理盐水制备瘤细胞悬液,调细胞数1xa0×10⁶个细胞/ml,按0.2ml/只接种于80只雌性C57BLxa0/6小鼠右前肢腋部皮下。将肿瘤接种小鼠随机分为8组,每组10只,分别为:模型组,过山蕨总黄酮组(50mg/kg体重/日),阿霉素组(5mg/kg体重/日)、环磷酰胺组(10mg/kg体重/日)、氟尿嘧啶组(15mg/kg体重/日)、过山蕨总黄酮+阿霉素组、过山蕨总黄酮+环磷酰胺组、过山蕨总黄酮+氟尿嘧啶组。肿瘤接种后次日,模型组和正常组灌胃生理盐水10ml/kg,过山蕨总黄酮组灌胃相应剂量的过山蕨总黄酮水溶液,环磷酰胺组和氟尿嘧啶组腹腔注射相应剂量的药物,每日1次,连续3周;阿霉素组尾静脉注射相应剂量的药物,每周1次,共3次;两种药物联用组按2种药物单独使用时的剂量和方式联合治疗。肿瘤长出后每周用游标卡尺测量肿瘤直径2xa0次,xa0肿瘤大小按下面公式计算:xa0肿瘤体积(xa0mm³)xa0=xa0肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/xa02。肿瘤接种后22日颈椎脱臼法处死全部小鼠,剥离接种部位肿瘤,称重。另剥离小鼠肺脏,检测出现肺肿瘤的小鼠数和每只小鼠肺表面出现的肿瘤结节数,评价过山蕨总黄酮对阿霉素、环磷酰胺、氟尿嘧啶治疗的小鼠lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响。结果:模型组小鼠皮下肿瘤生长较快,并全部出现肺转移。与模型组比较,阿霉素、环磷酰胺和氟尿嘧啶组小鼠皮下肿瘤生长虽均明显减缓,但肿瘤肺转移并无减轻。过山蕨总黄酮对小鼠皮下肿瘤生长抑制作用虽比阿霉素、环磷酰胺和啶氟尿嘧啶弱,但可同时可阻止肿瘤肺转移。过山蕨总黄酮与阿霉素、环磷酰胺和氟尿嘧联用后对小鼠皮下肿瘤生长抑制作用明显增强,且能显著降低肺转移(见图8,图9)。实验8:过山蕨总黄酮对小鼠4T1乳腺癌术后复发的影响。实验方法:取对数生长期4T1乳腺癌细胞,xa0用生理盐水调细胞数3×10⁵/ml,以0.1mxa0l/只接种于80只雌性BALB/c小鼠右侧第2乳头脂肪垫下。肿瘤接种后2周(肿瘤直径约10mm)手术切除肿瘤。将肿瘤切除后小鼠随机分为4组,每组20只,分别为:模型组,xa0过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量组(25mg/kg体重/日、50mg/kg体重/日、100mg/kg体重/日)。肿瘤切除后次日,模型组饮正常水和食正常饲料,xa0过山蕨总黄酮各剂量组按每只小鼠日食量将过山蕨总黄酮按所需剂量浓度掺入饲料中喂饲小鼠,观察肿瘤切除后26周内各组小鼠肿瘤复发和死亡情况。小鼠死后检测手术切除部位肿瘤及肺转移灶,xa0统计肿瘤复发和转移率。结果:模型组小鼠肿瘤手术切除后20只中有17只肿瘤复发,肿瘤复发小鼠全部有肺转移,中位存活时间为11周。经过山蕨总黄酮低剂量、中剂量、高剂量治疗后的小鼠肿瘤复发率均有不同程度降低,且肿瘤复发小鼠发生肺转移的比率降低,小鼠中位存活时间明显延长(见图10、图11)。